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>>dCas9實(shí)驗(yàn)流程
dCas9實(shí)驗(yàn)流程
CRISPR-dCas9實(shí)驗(yàn)流程
實(shí)驗(yàn)步驟 :
1.設(shè)計(jì)sgRNA
按照“20N+NGG(PAM)”的設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)sgRNA,至少設(shè)計(jì)3條。
2.構(gòu)建sgRNA和dCas9-target 質(zhì)粒
3.構(gòu)建dCas9-target穩(wěn)轉(zhuǎn)株
穩(wěn)轉(zhuǎn)株蛋白構(gòu)建完成后,用flag抗體或目的蛋白抗體檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株是否構(gòu)建成功,如果載體上有熒光蛋白,可用熒光檢測(cè)細(xì)胞株是否構(gòu)建成功。
圖3 熒光檢測(cè)圖片 A轉(zhuǎn)染篩選后明場(chǎng)圖片 B轉(zhuǎn)染篩選后熒光圖片 C未轉(zhuǎn)染加嘌呤篩選細(xì)胞
4.Flag-ChIP-QPCR驗(yàn)證sgRNA的工作效率
將sgRNA轉(zhuǎn)染至dCas9-target穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,ChIP檢測(cè)sgRNA的工作效率。
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