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gDNA設(shè)計
CRISPR Cas9系統(tǒng)只需設(shè)計一個包含20個堿基對的RNA寡核苷酸，即可靶向任何基因組位點。gRNA是CRISPR Cas9系統(tǒng)的重要組成部分，在設(shè)計gRNA序列時需要考慮諸多因素。
1.crRNA、tracrRNA and gRNA
在細(xì)菌和古細(xì)菌中，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）形成一個復(fù)合體，作為引導(dǎo)Cas9核酸酶降解外來遺傳物質(zhì)的引導(dǎo)裝置。 我們將tracrRNA和crRNA結(jié)合成一個單一的合成的gRNA，這個單組分系統(tǒng)不僅簡化了實驗設(shè)計，而且還產(chǎn)生了相同或更高的導(dǎo)向效率（圖1）。最常用的gRNA長約100個堿基對。 通過gRNA的5'端的特異性的20個堿基對（藍(lán)色區(qū)域），CRISPR Cas9系統(tǒng)可以靶向與該序列互補(bǔ)的任何基因組區(qū)域。
Figure 1 ：An example of the crRNA-tracrRNA complex and a gRNA
2 .gRNA設(shè)計原則
CRISPR Cas9系統(tǒng)的靶向特異性由gRNA 5'末端的20個核苷酸序列決定。 對于化膿性鏈球菌CRISPRCas9系統(tǒng)，所需的靶序列必須緊接在5'-NGG PAM基序（間隔子相鄰基序）之前，因此設(shè)計的序列為“20N+NGG3”。 gRNA通過互補(bǔ)堿基配對將Cas9核酸酶引導(dǎo)至靶序列，并且Cas9核酸酶使PAM序列上游?3個核苷酸處雙鏈DNA斷裂（圖2）
Figure 2： For the S. pyogenes system, the target sequence must be immediately adjacent to a 5’-NGG PAM sequence. The gRNA will form complementary base paring with the opposite strand of the target sequence and mediate a double strand break ~3bp upstream of the PAM sequence through the Cas9 nuclease.
由于一些啟動子可以限制靶點選擇和gRNA設(shè)計，因此選擇合適的啟動子驅(qū)動gRNA表達(dá)是必要的。 例如，依賴于RNA聚合酶III的U6啟動子或T7啟動子分別在RNA序列的5'端需要G或GG來啟動轉(zhuǎn)錄。 因此，如果U6或T7啟動子用于釀膿鏈球菌CRISPR系統(tǒng)中，那么靶序列分別限于下列形式：GN16-19NGG或GGN15-18NGG。 然而，通過將額外的G或GG添加到20個堿基對序列的5'末端（圖3），可以繞過這個限制。
Figure 3 – Sequence restrictions imposed by the use of U6 or T7 RNA polymerase III promoters for gRNA expression can be by passed as illustrated here.
?在設(shè)計gRNA的20個堿基對的引導(dǎo)序列時，應(yīng)考慮以下三點：
1）GC含量：典型的范圍在GC含量為40％-80％之間，其中GC含量較高的RNA更容易造成脫靶;
2）長度：長度可以調(diào)節(jié)，范圍從17-24堿基對，較短的序列導(dǎo)致最小的脫靶效應(yīng)；
3）避免gRNA的潛在脫靶位點。
?gRNA與靶位點之間的錯配耐受性可導(dǎo)致CRISPR Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，并且通常其發(fā)生取決于以下因素：
①.脫靶效應(yīng)與gRNA的序列，其中一些gRNA對錯配的耐受性比其它gRNA更小。
②.引入細(xì)胞的Cas9和gRNA之間的比例和比率也影響脫靶效應(yīng)，小心地滴定Cas9和gRNA可以降低這些效應(yīng)。
③. 通過非同源末端連接（NHEJ）途徑進(jìn)行基因沉默時，靶點需更接近于蛋白質(zhì)編碼區(qū)的N'端以產(chǎn)生最大的基因破壞。
④.基因組DNA的編碼鏈和非編碼鏈都可以被靶向，因為它們在產(chǎn)生突變方面同樣有效。
⑤如果基因組編輯需要同源性定向修復(fù)（HDR），則目標(biāo)位點的選擇受到期望的插入位置的限制。
在設(shè)計gRNA時，需要認(rèn)真考慮上面列出的各種要求。精心設(shè)計的gRNA將會產(chǎn)生更高的編輯效率和最小化脫靶效應(yīng)。
3.特殊的設(shè)計原則
當(dāng)使用成對的Cas9切口酶誘導(dǎo)的雙鏈斷裂時需要進(jìn)一步考慮。注意以下幾點很重要（圖4）：
ⅰ.理想情況下，切割時需要產(chǎn)生5'懸垂鏈。
ⅱ.兩個gRNA之間的距離不超過20個堿基。
ⅲ.兩個gRNA需要在相反鏈上設(shè)計靶序列。 請注意，PAM序列需要在目標(biāo)序列的上游。
在設(shè)計了兩種gRNA之后，它們可以以1：1的比例混合，并與Cas9 Nickase一起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。
Figure 4 ：When using paired Cas9 nickases additional considerations need to be given to the gRNA design. These include producing a 5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position of the two gRNA target sites.
4 .gRNA設(shè)計工具
有許多工具可以幫助我們設(shè)計gRNA的過程。在這里，我們將重點介紹兩個這樣的工具：Chop Chop Harvard和CRISPR Design。
?.Chop Chop Harvard
將一段感興趣基因序列或登錄號碼輸入到Chop Harop Harvard（圖5），軟件分析序列并鑒定緊接著PAM序列（5'-NGG）的所有可能的20bp序列。然后根據(jù)預(yù)先設(shè)定的代碼對GC進(jìn)行評分，該代碼查看GC含量和潛在脫靶位點，并將它們從最佳得分排列到最低得分。有關(guān)特定gRNA的更多信息，只需在gRNA序列上單擊即可。這將打開顯示該特定gRNA的潛在脫靶位點的頁面，甚至提供可用于通過SURVEYOR測定來篩選這些脫靶位點潛在突變的引物序列。
Figure 5 ：The Chop Chop Harvard results page highlighting the ranking, exon position, and potential off target site counts.
?.CRISPR Design
使用CRISPR Design的主要優(yōu)勢在于能夠提供所有潛在gRNA的脫靶目標(biāo)的詳細(xì)信息。 它使每一個gRNA序列都發(fā)生了突變，并提供了關(guān)于其脫靶位置和與設(shè)計的gRNA錯配數(shù)目的詳細(xì)報告。 當(dāng)設(shè)計兩個gRNAs用于配對的內(nèi)切酶活性時，該軟件也是優(yōu)越的，因為它會自動發(fā)現(xiàn)兩個彼此靠近的gRNA。
然而，這個軟件的主要缺點是它一次只能分析500個堿基對的序列。 因此，我們建議使用Chop Chop Harvard選擇潛在的gRNA序列，然后推薦進(jìn)一步的分析用CRISPR Design工具。
