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CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)（knock in）
CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)是Cas9內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，且有一段高度同源的DNA修復(fù)模板存在的情況下，生物體內(nèi)啟動HDR修復(fù)路徑，將一段外源DNA定點插入基因內(nèi)部。
同源性定向修復(fù)（HDR）途徑，對比NHEJ修復(fù)途徑，同源性定向修（HDR）途徑是更為精確的修復(fù)機(jī)制。 這種修復(fù)機(jī)制主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲入。 在該修復(fù)路徑中，需要將一段與預(yù)期編輯位點上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復(fù)模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細(xì)胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情況下， HDR機(jī)制可以通過同源重組將一段DNA插入編輯位點（圖4）。這種修復(fù)方式可以將一段DNA序列精準(zhǔn)地插入特定的基因組位點。
圖1基因敲入原理圖
?實驗流程
1 .設(shè)計sgRNA-Cas9及修復(fù)DNA模版
2 .構(gòu)建sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復(fù)DNA模板質(zhì)粒
3 .將sgRNA-Cas9、修復(fù)DNA模版共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞
4 .嘌呤篩選，檢測熒光
5 .PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入
?實驗步驟
1. 設(shè)計sgRNA及修復(fù)DNA模版
針對人類AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設(shè)計了sgRNA進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒有預(yù)測的脫靶結(jié)合位點。設(shè)計DNA修復(fù)模版，兩側(cè)同源臂，其兩側(cè)各有600bp的同源臂。
2 .構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒及修復(fù)DNA模板質(zhì)粒
將選定的sgRNA設(shè)計與CMV啟動子驅(qū)動的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制備pCas-Guide-AAVS1（圖2）。
將DNA修復(fù)模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表達(dá)載體（圖2）。
圖2 sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復(fù)DNA模版質(zhì)粒
3 .將sgRNA-Cas9、修復(fù)DNA模版共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞
用lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑將上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。
4. 嘌呤篩選，檢測熒光
嘌呤篩選3-4周
3-4周后，> 95％的HEK293細(xì)胞表達(dá)RFP（圖3）。
圖3 熒光檢測圖片 A轉(zhuǎn)染篩選后明場圖片 B轉(zhuǎn)染篩選后熒光圖片 C未轉(zhuǎn)染加嘌呤篩選細(xì)胞
5. PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入
為了證實在基因組DNA中敲入RFP，設(shè)計引物對，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因內(nèi)的引物2。
1.1kb的PCR產(chǎn)物表明在AAVS1位點敲入成功; 沒有PCR擴(kuò)增指示敲入不成功（圖4）。
圖4 PCR產(chǎn)物檢測，在對照細(xì)胞（'WT細(xì)胞'）中沒有看到PCR擴(kuò)增。
