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高通量測序分析

      高通量測序,一次性對幾百萬到十億條DNA分子進行并行測序,又稱為下一代測序技術(shù),其使得可對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行深入、細致、全貌的分析,所以又被稱為深度測序。主要包括:High-throughput Sequencing,Next Generation Sequencing,Deep Sequencing。

高通量測序流程

圖1  高通量測序流程

 

      高通量測序應用范圍廣泛:

      1 DNA測序:全基因組de novo測序,基因組重測序,宏基因組測序,人類外顯子組捕獲測序。

      2 RNA測序:轉(zhuǎn)錄組測序,小RNA測序,電子表達譜測序。

      3 表觀基因組研究:ChIP-Seq,DNA甲基化測序。

 

      基因組測序

      基因組測序是對物種的基因組DNA打斷后進行高通量測序,根據(jù)是否有已知基因組數(shù)據(jù)主要分為de novo全基因組測序和基因組重測序。De novo 基因組測序是對未知基因組序列的物種進行基因組從頭測序,利用生物信息學分析手段對序列進行拼接、組裝,從而獲得該物種的基因組圖譜。全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序,并在此基礎上對個體或群體進行差異性分析。

 

基因組測序策略

圖2  基因組測序策略

 

Paired-end原理

圖3  Paired-end原理

 

     Paired-End方法,基因組打斷后,選擇一定長度(200-500bp)的序列連接兩端接頭進行兩頭測序。Mate-end建庫較復雜,序列打斷后,選取一定長度序列(3-5kb),需先連接生物素,再環(huán)化,再打斷,生物素富集,連接兩端接頭進行兩端測序。

      基因組測序應用生物信息學分析其結(jié)果,主要涵蓋以下幾方面。

      1 數(shù)據(jù)產(chǎn)出處理:圖像識別與Base Calling\去除接頭序列、檢測與去除污染序列等;

      2 基因組組裝:原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計、測序深度分析、組裝結(jié)果統(tǒng)計等;

      3 基因組注釋:Coding Gene注釋、RNA分類注釋、重復序列注釋等;

      4 基因功能注釋:GO功能分類、Interpro功能分類等;

      5 比較基因組及分子進化分析:SNP/InDel/CNV檢測等。

 

      宏基因組測序

      宏基因組測序是對某一特定環(huán)境,如腸道、土壤、海水等中的所有微生物進行基因組測序。通過此方法可對該環(huán)境中的微生物種類和優(yōu)勢物種進行檢測,揭示微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系 。自然環(huán)境中很多微生物無法分離培養(yǎng),而此方法無需對微生物進行分離培養(yǎng)。宏基因組測序方法現(xiàn)在有全基因組的宏基因組測序和16S/18S rRNA宏基因組測序。

      1 全基因組的宏基因組測序

      通過高通量測序技術(shù),對環(huán)境樣品的總 DNA 直接進行全基因組的宏基因組測序,能夠?qū)崿F(xiàn)微生物群落的物種分類研究、群落結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化、功能注釋以及物種間的代謝網(wǎng)絡研究,挖掘具有應用價值的基因資源,開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。與傳統(tǒng)的 Sanger法相比,速度快,性價比高,周期短,單個樣品的測序量可以接近飽和。

      宏基因組測序信息分析主要包括:拼接組裝,物種分類組成分析,基因預測和功能注釋,生成Profiling table,主成分分析(PCA),篩選與樣品分組顯著相關(guān)的因子,多樣品間比較分析等。

      2 16S/18S rRNA宏基因組測序

      16S/18S rRNA是微生物群落分析和細菌進化研究以及分類研究最常用的靶分子,采用新一代測序技術(shù),對16S/18S rDNA的可變區(qū)進行測序分析,不需進行克隆篩選,能全面的反映微生物群體的物種組成,真實的物種分布及豐度信息。

16S/18S rRNA測序信息分析主要包括:物種分類、物種豐度分析,OTU(Operational Taxonomic Units)分析,多樣性分析,系統(tǒng)進化分析,多樣品間的比較分析等。

 

      人類外顯子組捕獲測序

      外顯子組是指全部外顯子區(qū)域的集合,該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息,涵蓋了與個體表型相關(guān)的大部分功能性變異。與全基因組重測序相比,外顯子組測序只需針對外顯子區(qū)域的DNA,覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準確性更高,更加簡便、經(jīng)濟、高效。

 

人類外顯子組捕獲測序原理

圖4  人類外顯子組捕獲測序原理

 

      外顯子捕獲是指用外顯子芯片雜交,把基因組外顯子序列進行捕獲,然后對所捕獲的序列進行測序。現(xiàn)在常用外顯子芯片有Roche NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome Array和Agilent SureSelect Target Enrichment System(Human Exome)。

 

人類外顯子組捕獲測序分析流程

圖5  人類外顯子組捕獲測序分析流程

 

      轉(zhuǎn)錄組測序

      轉(zhuǎn)錄組即特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和,包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding RNA)。

      第二代測序系統(tǒng)可精確檢測單個堿基,并且不受到研究中先驗信息的干擾,科研人員能夠快速地獲得某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA轉(zhuǎn)錄本序列,從而能夠開展:UTRs區(qū)域界定、可變剪切研究、低豐度新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)、融合基因鑒定、cSNP(編碼序列單核苷酸多態(tài)性)研究等。

 

轉(zhuǎn)錄組測序流程

圖6  轉(zhuǎn)錄組測序流程

 

無參考序列及有參考序列轉(zhuǎn)錄組測序流程

圖7  無參考序列及有參考序列轉(zhuǎn)錄組測序流程

 

      無參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容包括:1 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計,數(shù)據(jù)成分和質(zhì)量評估;2 Contig及Scaffold長度分布;3 Unigene的長度分布和功能注釋,GO分類,Pathway分析,差異表達分析;4 蛋白功能預測與分類,差異表達基因GO富集和 Pathway富集分析。

      有參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容包括:1 基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計,比對參考序列;2 序列在基因組上在分布;3 測序深度分析、隨機性評估和基因差異表達分析;4 新基因預測,基因可變剪接鑒定和基因融合鑒定等。

 

      電子表達譜測序

      電子表達譜測序(Digital Gene Expression, DGE)又稱為基因表達標簽測序(mRNA tag profiling),又稱Tag-SAGE。其原理是通過兩種酶切作用對基因中一段長度為21nt的序列標簽進行測序。由于其測序只針對表達的基因進行測序,產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量相對較小,是研究基因表達譜的經(jīng)濟而快速的研究手段。是對特定處理條件下的全基因組基因表達譜進行分析,已被廣泛用于功能基因組學和醫(yī)學等研究領域。

 

電子表達譜測序流程圖

圖8  電子表達譜測序流程圖

 

      電子表達譜分析內(nèi)容包括:圖像識別與原始堿基數(shù)據(jù)讀取,去污染、去接頭,標簽序列計數(shù)統(tǒng)計,基因組比對與統(tǒng)計,基因序列比對獲得所表達的基因列表,基因差異表達分析,聚類與表達類型分析,GO基因富集與分類分析,Pathway富集與分類分析,蛋白相互作用網(wǎng)絡分析,反義鏈轉(zhuǎn)錄本與新轉(zhuǎn)錄本檢測等。

 

      小RNA測序

      小 RNA是指長度在21-31nt的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼RNA,廣泛存在于高等和低等生物體內(nèi),其對mRNA的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等生命過程起到調(diào)節(jié)作用?,F(xiàn)已知小RNA可歸納成三類:微RNA (miRNA),小干擾RNA(siRNA)和與piwi相互作用的RNA(piRNA)。

      miRNA長度為21~24nt,產(chǎn)生于有典型莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的原轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA),在動植物的目標mRNA的降解與抑制方面發(fā)揮重要作用。siRNA,長度在19~25nt,產(chǎn)生于長雙鏈RNA,同樣在動植物的目標mRNA的降解與抑制方面發(fā)揮重要作用。piRNA,長度26~31nt,由與其相互作用的Piwi蛋白定義,目前研究表明其在配子形成的過程中起作用。

 

小RNA測序流程圖

圖9  小RNA測序流程圖

 

      小RNA測序分析內(nèi)容包括以下兩個主要方面:

      1 基本分析:原始數(shù)據(jù)讀取,去接頭、去污染序列,長度分布統(tǒng)計,基因組比對等。

       2 高級分析:Small RNA的分類注釋,miRNA / siRNA / piRNA的鑒定,新miRNA預測,差異表達miRNA聚類分析等。

 

      ChIP-Seq

      ChIP-Chromatin Immunoprecipitation染色質(zhì)免疫共沉淀,是指通過蛋白免疫相互作用,用抗體把和染色質(zhì)相互作用的蛋白,如組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等,沉淀下來,從而所獲取與其相結(jié)合的DNA序列。ChIP-Seq就是通過高通量測序?qū)hIP所得到的序列進行測序,從而進行蛋白和DNA相互作用相關(guān)研究。

      ChIP-Seq分析內(nèi)容包括:

      1 ChIP Sequencing結(jié)果與參考基因組序列進行比對。

      2 ChIP Sequencing reads 在全基因組的分布:唯一比對reads 在repeats 區(qū)域的分布,唯一比對reads 在各基因功能元件上的分布,唯一比對reads 的全基因組覆蓋深度。

      3 全基因組peak 掃描:peak 掃描,peak 長度分布統(tǒng)計,peak 的全基因組覆蓋度,peak 在基因功能元件上的分布特征,

      4 Peak相關(guān)基因分析篩選與GO功能富集分析。

      5 多個樣品的差異分析:基于peak 相關(guān)基因的差異分析,基于peak 的差異分析。

 

ChIP-Seq分析流程

圖10  ChIP-Seq分析流程

 

      DNA甲基化測序

      DNA甲基化對機體發(fā)育和基因表達有很重要的調(diào)控作用,和各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展也有很大相關(guān)性,所以對基因組DNA甲基化進行研究是一直來的熱門課題。通過高通量測序來研究DNA甲基化現(xiàn)在主要有兩種方法,一種是MeDIP,是通過與DNA甲基化位點相結(jié)合的抗體,進行免疫共沉淀,然后對所得DNA序列進行測序。另一種是Bisulfite Sequencing,是通過Bisulfite處理基因組來區(qū)分甲基化位點。

 

MeDIP 原理

圖11  MeDIP 原理

 

      MeDIP-Seq分析內(nèi)容包括:

      1 MeDIP-seq 序列與參考序列的比對。

      2 MeDIP-seq 序列數(shù)據(jù)在全基因組的分布趨勢: MeDIP-seq 測序reads 在全基因組上每條染色體上的分布,MeDIP-seq 測序reads 在全基因組上的覆蓋深度,MeDIP-Seq 測序reads 在CG、CHG和CHH位點上的覆蓋深度,MeDIP-Seq 測序reads 在不同基因功能元件上的分布,MeDIP-Seq 測序reads 在不同OE含量區(qū)域中的分布。

      3 統(tǒng)計MeDIP-seq 序列富集區(qū)域(peak)的信息:Peak 掃描,Peak 長度數(shù)量及比例分布統(tǒng)計,單個樣品Peak 的OE含量分布統(tǒng)計,尋找Peak 相關(guān)基因,統(tǒng)計Peak 在不同基因功能元件上的分布。

      4 基于Peak 的多樣品間差異分析:分析兩個樣品間的Peak 相關(guān)差異基因,對兩個樣品間的差異基因進行GO功能富集分析及pathway 功能分析。

 

Bisulfite Sequencing原理

圖12  Bisulfite Sequencing原理

 

      Bisulfite Sequencing分析內(nèi)容包括:

      1 Bisulfite-seq序列與參考序列的比對。

      2 深度和覆蓋度分析:C堿基有效測序深度的累積分布,不同reads 測序深度下的基因組覆蓋度。

      3 計算C堿基的甲基化水平。

      4 全基因組甲基化數(shù)據(jù)分布趨勢分析:甲基化C堿基中CG, CHG 與CHH的分布比例(H=A、C or T),CG、CHG和CHH中的所有C的甲基化水平,各條染色體中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平(該項分析目前只用于“人”),統(tǒng)計不同基因區(qū)域內(nèi)CG、CHG和CHH中C的甲基化水平,不同基因元件區(qū)域中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平,CHG,CHH中甲基化C附近的9bp序列的序列特征分析。

      5 全基因組DNA 甲基化圖譜:染色體水平的甲基化C堿基的密度分布(該項分析目前只用于“人”),Scaffold的甲基化C堿基密度分布(該項分析針對物種:非人),不同基因組區(qū)域的甲基化分布特征,基因組不同轉(zhuǎn)錄元件中的DNA甲基化水平。

      6 差異甲基化區(qū)域(DMR)分析。

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