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RNA pull-down實驗服務 | 廣州賽誠生物科技有限公司 |
實驗技術流程
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實驗常見問題
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結(jié)果分析
對于一幅RNA pull-down實驗結(jié)果Figure,應包含位點作用示意圖、WB或質(zhì)譜結(jié)果數(shù)據(jù)分析圖,并應在Supplement中補充相關的驗證性實驗圖片,具體如下圖所示。
RNA 序列: G表示空間構象的變化, AS表示互補鏈的的二級結(jié)構, S表示正義鏈的二級結(jié)構。
Figure A:
用不同的A、AS、G RNA序列去Pulling Down蛋白符合物,并用不同的KCL濃度梯度洗脫。蛋白抗體NCL hnRNP U hnRNP F RPL7 hnRNP K的單抗進行WB實驗。檢測A AS G特定區(qū)段的結(jié)合的蛋白復合物的組分。
Figure B:
RNA Pull down后的將蛋白復合物進行質(zhì)譜實驗,發(fā)現(xiàn)結(jié)合蛋白NCL的肽段。不同RNA構象A、AS、G結(jié)合的肽段的不同。
Figure C:
通過重組NCL到GST上,通過GST Pull down 捕獲符合物,進行qRT-PCR檢測RNA片段AS、S、G和細胞組成型表達RNA(Unbound RNA GAPDH)。
Figure D:
RNA Pull down結(jié)果進行SDSPAGE電泳檢測。上面四泳道分別為不同的RNA捕獲方式,UTP生物素化,無生物素化等。
Supplement:
A RNA motif(結(jié)構域)注釋和motif生物素化結(jié)合鏈霉親和素。
B 在不同的處理條件下(ATP depletion)下進行RNA pulling down后用 Cup和Smaug 蛋白單抗進行WB檢測。
C RNA Pull down的RNA探針,在加上Cap帽子結(jié)構和不加帽子的情況下捕獲的蛋白用elF4G翻譯延伸因子 CuP蛋白進行WB。有帽子結(jié)構的才能有翻譯效應。