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RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)(RIP)實(shí)驗(yàn)常見問題

1RIP試驗(yàn)需要注意什么?

1)防止RNA與蛋白非特異性結(jié)合。(2)避免RNA蛋白質(zhì)結(jié)合被破壞。

3)避免外源RNase污染。        4)抑制內(nèi)源RNase的活性。

5)選擇適合做RIP的抗體。      6)避免RNA結(jié)合蛋白的降解。

 

2:為什么抗體無法沉淀RIP裂解液中的目標(biāo)蛋白?

1)先進(jìn)行IP或者WB,測試抗體可以與目標(biāo)RBP結(jié)合。

2)另選一個(gè)能與抗原其他表位結(jié)合的抗體。

3)盡可能選用密理博RIPAb+抗體。

4)稀釋抗體成濃度梯度,進(jìn)行IP測試。

54過夜孵育抗體與RIP裂解液。

6)確定抗體類型與Protein A/Protein G匹配。

 

3:提取RNA時(shí),蛋白酶K消化不完全是什么原因?

當(dāng)進(jìn)行蛋白酶K消化時(shí),確保水浴溫度應(yīng)設(shè)置在55左右,長期在65以上孵育會導(dǎo)致蛋白酶K失活。

 

4:提取RNA后,A260/A280比值偏離1.8~2.2區(qū)域是什么原因?

1)需要縮短酚氯仿提取RNA的時(shí)間間隔。

2)測試提純后RNA中是否存在RNA酶,可能RNA發(fā)生了降解。

 

5:做RIP的時(shí)候和beads孵育的lysate的濃度如何確定?有些動物的文獻(xiàn)提到用細(xì)胞板數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù),想知道如果用蛋白濃度的話,大概在什么數(shù)量范圍的蛋白總量對應(yīng)50 ul BEADS?

50 ul beads對應(yīng)的是一個(gè)reaction,而我們推薦一個(gè)reaction100ul裂解上清(2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到),所以只需要在裂解前計(jì)數(shù)一下,并按括號中的比例加入裂解buffer,后續(xù)100 ul 裂解上清就是一個(gè)reaction的蛋白用量。不建議通過裂解后測蛋白濃度的方法進(jìn)行配比。

 

6RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物嗎?

理論上,可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本,再進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。但需要特別注意的是所用kit中的reagent不能有RNaseDNase,以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

 

7:因?yàn)?/span>RIP做完得到的是RNA序列,要做后續(xù)檢測,比如測序、判斷目標(biāo)序列位置等,是不是都必須要做RT-PCR,得到逆轉(zhuǎn)錄的DNA后,后面就跟ChIP相同了?

常見的用real time qRT-PCR。如果對照的目的是保證兩個(gè)樣品間加入的細(xì)胞量一致或者進(jìn)行定量,理論上說,使用input作為判別,計(jì)算不同樣品上樣量的差異。如果對照的目的是為了看IgG以及目的抗體富集的非特異性mRNA的量的話,那么可以找一個(gè)確定不會與目的抗體結(jié)合的RNA片段設(shè)計(jì)primer進(jìn)行qPCR,用來看IgG以及目的抗體拉下來的背景情況。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用,但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物,RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同(如復(fù)合物不需要固定,RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶,抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等)


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