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3D模型驗(yàn)證技術(shù)
基因組模型構(gòu)建完成后,我們需要對模型進(jìn)行驗(yàn)證。主要從兩個方面對模型進(jìn)行驗(yàn)證,一個是模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證,一個是對模型功能進(jìn)行驗(yàn)證。對模型結(jié)構(gòu)驗(yàn)證,我們也是從兩個方面進(jìn)行驗(yàn)證,一個利用DNA FISH對模型的空間定位進(jìn)行研究,一個是利用3C對模型的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證。對模型的功能驗(yàn)證,我們主要利用CRISPR技術(shù)去除模型結(jié)構(gòu),觀察對應(yīng)基因及細(xì)胞代謝的變化。
DNA FISH-模型空間定位驗(yàn)證
DNA FISH的基本流程與RNA及蛋白FISH相似,但DNA FISH探針要求更加嚴(yán)格,且細(xì)胞內(nèi)的DNA及探針均需要變性。DNA FISH是觀察細(xì)胞核中DNA分步,這需要更高放大倍數(shù)的共聚焦顯微鏡。
如下圖所示,在母本染色體中,三個基因是分開的,在父本染色體中,3個基因經(jīng)過環(huán)形折疊在一起。
3C-模型空間結(jié)構(gòu)驗(yàn)證
3C的基本流程如下圖所示。染色質(zhì)先進(jìn)行交聯(lián),交聯(lián)后酶切,連接,再進(jìn)行QPCR檢測。3C技術(shù)主要捕獲的是兩基因間的互作,因此這種技術(shù)常用來驗(yàn)證基因間的互作。
下圖所描述的是基因promoter區(qū)與增強(qiáng)子區(qū)的互作驗(yàn)證,我們可以看到FIP1L1與914kb處的增強(qiáng)子有互作。
CRISPR-模型功能驗(yàn)證
我們利用CRISPR 技術(shù)敲掉CTCF motif,使CTCF無法結(jié)合,基因組的3D結(jié)構(gòu)模型被破壞,相應(yīng)基因的表達(dá)受到影響,細(xì)胞功能也可能會受到影響。CRISPR的功能是強(qiáng)大的,您可以根據(jù)您的需要敲除增強(qiáng)子,沉默子,絕緣子,甚至基因。
CTCF位點(diǎn)被定點(diǎn)敲除
酶切檢測敲除效率
PCR檢測位點(diǎn)敲除后的基因變化
位點(diǎn)敲除后的功能檢測