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miRNA的一般研究策略
日期:2019-03-26 標(biāo)簽:miRNA的一般研究策略
miRNA也稱微RNA、microRNA,是真核生物中廣泛存在的一種長(zhǎng)度為21-23nt的RNA分子,可通過(guò)與mRNA的結(jié)合,抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄,因此在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作用。
圖1 miRNA的一般研究策略及相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段
1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因
要對(duì)miRNA進(jìn)行研究,首先需要采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因位點(diǎn),即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。
2 靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果確認(rèn)
進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)之后,接著是要通過(guò)miRNA pulldown方法,識(shí)別靶基因位點(diǎn)。其中,有以下三種常用的pull-down方法:
(1)生物素化的miRNA pull-down(biotinylated miRNA pull-down)。通過(guò)生物素標(biāo)記的合成miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,孵育后裂解細(xì)胞,用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。
圖1 miRNA的一般研究策略及相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段
1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因
要對(duì)miRNA進(jìn)行研究,首先需要采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因位點(diǎn),即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。
2 靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果確認(rèn)
進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)之后,接著是要通過(guò)miRNA pulldown方法,識(shí)別靶基因位點(diǎn)。其中,有以下三種常用的pull-down方法:
(1)生物素化的miRNA pull-down(biotinylated miRNA pull-down)。通過(guò)生物素標(biāo)記的合成miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,孵育后裂解細(xì)胞,用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。
圖2 生物素化的miRNA pull-down
(2)標(biāo)記的miRNA pull-down(labeled microRNA pull-down assay,LAMP),通過(guò)用地高辛(DIG)標(biāo)記的pre-miRNA寡核苷酸與細(xì)胞提取物混合孵育,用抗地高辛的抗體做免疫共沉淀(IP),獲得被共沉淀的mRNA。
(3)核蛋白免疫共沉淀-RNA高通量測(cè)序(Ribonucleoprotein immunoprecipitation followed by microarray chip analysis,RIP-Chip,RIP-seq),通過(guò)用合成的miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,孵育后裂解細(xì)胞,用特異的抗AGO2抗體對(duì)RISC進(jìn)行免疫共沉淀,對(duì)獲得的mRNA進(jìn)行microarray分析。
圖3 RIP-Chip基本實(shí)驗(yàn)流程
3 miRNA的直接功能確認(rèn)
通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證miRNA是否能特異結(jié)合靶mRNA并特異抑制其表達(dá)。
(1)3’-UTR reporter assay
通過(guò)在報(bào)告基因如熒光素酶CDS的下游3’-UTR區(qū)域插入待確認(rèn)的目的基因,克隆到載體如psiCHECK-2上,載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,再用miRNA進(jìn)行處理,如果目的基因上含有靶位點(diǎn),則熒光素酶的轉(zhuǎn)錄受到抑制不發(fā)熒光。
圖4 3’-UTR報(bào)告基因基本實(shí)驗(yàn)流程
圖5 3’-UTR報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA直接作用情況
(2)miRNA的上調(diào)與下調(diào)
通過(guò)人工合成miRNA模擬物(miRNA mimics)或miRNA抑制物(miRNA inhibitor),增強(qiáng)或抑制miRNA的抑制效果,并與對(duì)照相比。
圖6 miRNA的上調(diào)與下調(diào)驗(yàn)證miRNA直接作用情況
(3)位點(diǎn)定向突變(site-directed mutagenesis)
首先,將待測(cè)基因反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)用致突變的引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增;然后,用相關(guān)的酶(一般為Kinase-Ligase-DpnI)對(duì)cDNA模板進(jìn)行消化,克隆到報(bào)告基因載體;最后,將構(gòu)建好的克隆轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。若表達(dá)顯著下降,可表明靶位點(diǎn)定位準(zhǔn)確。
圖7 位點(diǎn)定向突變基本實(shí)驗(yàn)流程
4 miRNA的整體功能驗(yàn)證
對(duì)miRNA的上調(diào)/下調(diào),通過(guò)Western Blot或其他生物學(xué)通路分析實(shí)驗(yàn),探究miRNA最終是如何影響細(xì)胞、疾病等等情況。
5 miRNA的定量和定位
通過(guò)RT-qPCR、原位雜交(in situ hybridization)、microarray等實(shí)驗(yàn)手段,確定miRNA的具體表達(dá)量及其所在位置,以明確補(bǔ)充其機(jī)理研究。